CRISPR-Cas9 基因组编辑方法使用 Cas9 核酸内切酶产生 DNA 双链断裂。Cas9 核酸内切酶需要 CRISPR RNA (crRNA) 来指定 DNA 目标序列，crRNA 必须与反式激活 crRNA (tracrRNA) 结合以激活核酸内切酶并产生具有编辑功能的核糖核蛋白复合物。在另一种方法中，crRNA 和 tracrRNA 可以作为单链 RNA 寡核苷酸导入。切割后，通过非同源末端连接 (non-homologous end-joining, NHEJ) 或同源定向重组修复 (homology-directed recombination, HDR) 对 DNA 进行修复，从而得到一个经过修饰的序列。Alt-R CRISPR-Cas9 试剂和试剂盒提供了利用该通路进行基因组编辑研究所需的经过优化的重要工具。

    Cas9 核酸内切酶定向到基因组目标区域的 Alt-R CRISPR-Cas9 系统的组分。对于双链体引导 RNA 格式，crRNA:tracrRNA 复合物利用经优化的 Alt-R crRNA 和 tracrRNA 序列杂交，然后与 Cas9 核酸内切酶形成复合物，以引导对基因组 DNA 的靶向切割。或者，包含相关 crRNA 和 tracrRNA 序列的 sgRNA（未显示）与 Cas9 核酸内切酶形成复合物，引导对基因组 DNA 的靶向切割。切割位点由 crRNA 的间隔序列元件（浅蓝色条）指定。crRNA 间隔序列元件在与 NGG PAM 位点相对的链上识别 19 或 20 nt。PAM 位点必须紧挨在间隔序列元件的下游才能进行切割。IDT 科学家的研究表明，与采用天然化脓性链球菌 crRNA:tracrRNA 的竞争设计相比，Alt-R CRISPR-Cas9 系统的基因组编辑中靶率更高。